可以這樣說(shuō)，對(duì)于需要消化傳代的細(xì)胞，每一次的消化都是對(duì)這個(gè)細(xì)胞存活與否，狀態(tài)好與不好最至關(guān)重要的考驗(yàn)。

在消化的過(guò)程中，你加入胰酶后，所有細(xì)胞都在被胰酶消化著，但是我們忽視了一個(gè)問(wèn)題。細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)是不一樣的，每一個(gè)細(xì)胞的貼壁情況也是不一樣的。我后來(lái)對(duì)消化的方法進(jìn)行了改良，我稱之為「四步消化法」。以難消化細(xì)胞為例，具體操作如下：

首先不加胰酶，倒掉舊培養(yǎng)基加入少量新培養(yǎng)基洗 1-2 遍，目的是將漂浮著的死細(xì)胞之類盡量洗掉。

然后再加入少量新培養(yǎng)基直接吹打一遍，這一遍是把貼壁不牢固的細(xì)胞吹打下來(lái)。再用培養(yǎng)基洗一遍，兩次所得懸液混合傳入新瓶。你可以將這些傳入新瓶培養(yǎng)，以與后面胰酶消化過(guò)的細(xì)胞對(duì)比觀察看誰(shuí)長(zhǎng)的更好一點(diǎn)就知道該細(xì)胞對(duì)胰酶的敏感度。

吸干凈瓶?jī)?nèi)剩余液體，加入 0.3 ml 左右的胰酶潤(rùn)洗一遍，吸掉棄之，再加入 1 ml 左右的胰酶消化。消化的同時(shí)置于顯微鏡下觀察，待細(xì)胞與細(xì)胞之間間隙明顯的時(shí)候立即吸掉胰酶與干凈里備用，加入新培養(yǎng)基開(kāi)始吹打，吹打 2-3 遍后吸取懸液于試管或新瓶暫存。用 2 ml 左右新培養(yǎng)基洗一遍與前面的混合。你也可以傳入新瓶培養(yǎng)，以與后面及前面的做對(duì)比。

然后把前面剛吸出來(lái)的胰酶重新加進(jìn)瓶里，繼續(xù)消化剩余的貼壁牢固的細(xì)胞。當(dāng)然你也可以用新的胰酶。繼續(xù)鏡下觀察，待剩余細(xì)胞間隙明顯，細(xì)胞獨(dú)立開(kāi)來(lái)的時(shí)候，吸掉胰酶，加入新培養(yǎng)基吹打。懸液傳入新瓶培養(yǎng)，根據(jù)你實(shí)際情況自己把握。

其實(shí)還可以有第五步，對(duì)于特別難消化的細(xì)胞和對(duì)胰酶特別敏感的細(xì)胞的話，你可以繼續(xù)加第五步甚至第六步。為了細(xì)胞更好的狀態(tài)，更漂亮的樣子，沒(méi)辦法，你必須分多批多次消化，這樣才能最大限度地將胰酶對(duì)細(xì)胞的損傷降到低，保證細(xì)胞的狀態(tài)能夠優(yōu)。

當(dāng)然了，如果細(xì)胞是屬于那種很容易消化的細(xì)胞，像 RAW264.7，僅僅第二步就搞定。就沒(méi)必要第三步第四步了。這個(gè)需要你在實(shí)驗(yàn)中自己用心去體會(huì)。建議你接受一個(gè)新細(xì)胞時(shí)把各步消化的細(xì)胞分別培養(yǎng)起來(lái)做比較，去摸索好細(xì)胞對(duì)胰酶的要求。便于你后續(xù)實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展。

將細(xì)胞消化分成這幾步，除了是為了避免胰酶對(duì)細(xì)胞的損傷之外，還有一個(gè)更重要的作用就是，可以程度地把細(xì)胞吹打成單個(gè)單個(gè)的狀態(tài)，不成片不連體。

因?yàn)榧?xì)胞生長(zhǎng)的時(shí)候肯定是要相互聯(lián)系，大部分的細(xì)胞都是要成片生長(zhǎng)的，尤其是對(duì)于貼壁細(xì)胞，單個(gè)細(xì)胞貼壁之后長(zhǎng)著長(zhǎng)著就長(zhǎng)到一片去了。但是如果是成片的細(xì)胞抱團(tuán)的話，傳代后細(xì)胞是不能貼壁的，這樣抱團(tuán)的細(xì)胞就會(huì)死亡。所以，消化傳代的時(shí)候一定要將細(xì)胞消化成單個(gè)的獨(dú)立狀態(tài)，這個(gè)非常考究你的功夫。

細(xì)胞一旦脫落入懸液里，你很難再將他吹打成單個(gè)。所以必須要在細(xì)胞未脫落之前將其吹打開(kāi)，受力點(diǎn)就是細(xì)胞貼壁的地方。既要消化到容易吹打下來(lái)，又不能太過(guò)，一吹就整片脫落，要單個(gè)單個(gè)地往下掉。所以我才要分批分次地加胰酶消化就是為了保證不同生長(zhǎng)狀態(tài)貼壁程度的細(xì)胞能夠都維持在好的受力點(diǎn)分散開(kāi)。這個(gè)是很重要的一點(diǎn)。

另外關(guān)于傳代很重要一點(diǎn)就是，一定不能等到細(xì)胞長(zhǎng)滿的時(shí)候才去消化傳代。要在細(xì)胞長(zhǎng)到 70% 左右的時(shí)候就要傳代了，一旦發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)中已經(jīng)有疊層生長(zhǎng)的時(shí)候就要立即進(jìn)行消化傳代。不能再拖了。

千舍生物部分細(xì)胞*：

5637 人膀胱癌細(xì)胞

293T 人腎細(xì)胞

3T3-L1  小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(前脂肪)

786-O   人腎透明細(xì)胞腺癌細(xì)胞

A375 人惡性黑色素瘤細(xì)胞

A431 人表皮癌細(xì)胞

A549 人肺腺癌細(xì)胞

AAV-293 人胚腎細(xì)胞

ARPE-19 人視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞

AsPC-1 胰腺導(dǎo)管腺癌

AV3 人宮頸癌細(xì)胞

B16 小鼠黑色素瘤細(xì)胞

BCPAP 人甲狀腺癌乳頭狀細(xì)胞

Bend.3 小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞

BT-474 人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞

BT-B 人膀胱癌細(xì)胞

BV-2 小鼠小膠質(zhì)瘤細(xì)胞

C6 大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞

CaCO2 人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞

CALU-6 人肺腺癌細(xì)胞

chang liver 人張氏肝細(xì)胞/人乳頭瘤病毒相關(guān)的子宮頸腺癌細(xì)胞

CHO-K1 中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞系

COLO320 人結(jié)腸癌細(xì)胞

COLO320-GFP-puro(GHRLOS過(guò)表達(dá))

COLO320-GFP-puro(LV5-NC)

COS-7 非洲綠猴腎細(xì)胞

CT26.wt       小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞

DAMI 人巨核細(xì)胞白血病細(xì)胞

DC2.4 小鼠樹突狀細(xì)胞

DF-1 雞胚成纖維細(xì)胞系

DU145    人前列腺癌細(xì)胞

ECV-304 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株

EH-GB1 首株來(lái)源于轉(zhuǎn)移灶的人膽囊癌細(xì)胞系

FaDu 人咽鱗癌細(xì)胞

GBC-SD 人膽囊癌細(xì)胞系

GH3 大鼠垂體瘤細(xì)胞

GT1.1 小鼠垂體瘤細(xì)胞

H446 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞

H9C2（2-1） 大鼠心肌細(xì)胞

HaCaT 人永生化表皮細(xì)胞

HCC15 鱗狀細(xì)胞肺癌

HCCLM3 人高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞

HCT116 人結(jié)腸癌細(xì)胞

HCT-116/L-OHP 人結(jié)腸癌奧沙利鉑耐藥細(xì)胞

HCT-8 人結(jié)腸癌細(xì)胞

HDF 人真皮成纖維細(xì)胞

HEL    人紅白細(xì)胞白血病細(xì)胞

HELA 人宮頸癌癌細(xì)胞

HELA-LUCI Luciferase穩(wěn)定表達(dá)Hela細(xì)胞

HEPG2 人肝癌細(xì)胞

HFF-1 人包皮成纖維細(xì)胞

HGC-27 人胃癌細(xì)胞(未分化)

HK-2 人腎小管上皮細(xì)胞

HO8910PM 人高轉(zhuǎn)移卵巢漿液性囊腺癌細(xì)胞

Hs578T 人乳腺癌細(xì)胞（浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌）

HT-29   人結(jié)腸癌細(xì)胞

HUCCT1 人膽管細(xì)胞癌

I Shikawa 人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞

J774A.1 小鼠單核巨噬細(xì)胞

J82    人膀胱癌細(xì)胞

K562 慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞

KYSE150 人食管鱗癌細(xì)胞

L02 人正常肝細(xì)胞

L6 大鼠成肌細(xì)胞

L929 小鼠成纖維細(xì)胞

LLC 小鼠 Lewis(肺癌細(xì)胞)

LOVO 人結(jié)直腸癌細(xì)胞

LX-2 人肝星狀細(xì)胞

MC3T3-E1 小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞

MCF-10A 人正常乳腺細(xì)胞

MDA-MB-231 乳腺癌細(xì)胞

MDBK 牛腎細(xì)胞

MDCK 狗腎轉(zhuǎn)化細(xì)胞

MG63 人成骨肉瘤細(xì)胞

MIA PaCa-2 胰腺癌細(xì)胞系

MKN28 人胃癌細(xì)胞

MKN45 人胃癌細(xì)胞

MKN74 人胃癌細(xì)胞

mMSC 小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞

MOLT4 成人T急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞

NCI-H1650 微創(chuàng)肺腺癌細(xì)胞

NCI-H1975 人非小細(xì)胞肺腺癌細(xì)胞

NCI-H460     大細(xì)胞肺癌細(xì)胞

NIH-3T3 小鼠胚胎成纖維細(xì)胞

OVCAR-3 人卵巢癌細(xì)胞

OVCAR-8 高級(jí)別卵巢漿液性腺癌細(xì)胞

P53R(JHU-56) 人結(jié)直腸癌細(xì)胞

PANC-1    人胰腺癌細(xì)胞

PANC-1 GFP-NC 人胰腺癌細(xì)胞 帶綠色熒光

PANC-1 TRPM2-siRNA 人胰腺癌細(xì)胞 TRPM2基因抑制

PA-TU-8988T 人胰腺細(xì)胞

PC-12（低分化） 大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤分化細(xì)胞株

PC-12(高分化)   大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤分化細(xì)胞株

PECA 小鼠皮膚鱗狀細(xì)胞癌

PH 成人急性單核細(xì)胞白血病

PK-15 豬腎細(xì)胞

Raji 人B淋巴瘤細(xì)胞

RAW264.7   小鼠單核細(xì)胞

RSC96 大鼠雪旺細(xì)胞

Saos-2 人成骨肉瘤細(xì)胞

SCL-1 人皮膚鱗癌細(xì)胞

SK-BR-3 人乳腺癌傳代細(xì)胞

SK-OV-3 人卵巢癌細(xì)胞

SMMC-7721 人肝癌細(xì)胞

SNU-899 上呼吸消化道鱗狀細(xì)胞癌

SPEC-2 子宮內(nèi)膜漿液性表面乳頭狀癌細(xì)胞

ST 豬胎睪丸細(xì)胞

SU-DHL-6 彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤生發(fā)中心B細(xì)胞型

SV40 MES 13 小鼠腎小球系膜細(xì)胞

SV-HUC-1 人正常膀胱上皮細(xì)胞

SW480   人結(jié)直腸癌細(xì)胞

SW620 人結(jié)腸腺癌細(xì)胞

SW900 肺鱗狀細(xì)胞癌

T24   人膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞

TE-1 人食管癌細(xì)胞

THP-1 人急性單核細(xì)胞白血病單核細(xì)胞株

TM3 小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞

TPC-1 人甲狀腺乳頭狀癌的細(xì)胞系

U118MG 人星形膠質(zhì)細(xì)胞

U266 人骨髓瘤細(xì)胞

U87MG  人腦星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤

WiDr 人大腸癌細(xì)胞

Yac-1 小鼠淋巴瘤細(xì)胞

山羊MSC細(xì)胞 山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

山羊關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞