新買(mǎi)或惠贈(zèng)的細(xì)胞

1.新買(mǎi)的或惠贈(zèng)的細(xì)胞如何處理？

不管買(mǎi)的細(xì)胞、惠贈(zèng)的細(xì)胞，剛拿到手應(yīng)趕緊做這幾件事：檢測(cè)瓶子是否破裂；培養(yǎng)基是否漏出，是否渾濁；是否有支原體污染；迅速擴(kuò)增凍存。

2.能否使用與原先培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)基？

不能。每一細(xì)胞株均有其特定使用且已適應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)基，若驟然使用和原先提供培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)基，細(xì)胞大都無(wú)法立即適應(yīng)，造成細(xì)胞無(wú)法存活。

3.購(gòu)買(mǎi)的細(xì)胞死亡或存活率不佳可能原因？

常見(jiàn)原因可能有：培養(yǎng)基使用錯(cuò)誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳；血清使用錯(cuò)誤或血清的品質(zhì)不佳；解凍過(guò)程錯(cuò)誤；冷凍細(xì)胞解凍后，加以洗滌細(xì)胞和離心；懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞；培養(yǎng)溫度使用錯(cuò)誤；培養(yǎng)箱氣體濃度達(dá)不到要求；細(xì)胞置于 –80 ℃ 太久。

復(fù)蘇凍存的細(xì)胞

4.收到的冷凍管瓶身破裂，瓶蓋有裂紋，或瓶蓋脫落的原因？

冷凍管瓶蓋裂紋，或瓶身破裂，可能是因?yàn)椴僮髡邐A取冷凍管時(shí)用力不當(dāng)，造成冷凍管裂損，建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動(dòng)或松脫，是因熱脹冷縮的物理現(xiàn)象，冷凍管有可能因此而造成細(xì)胞污染，故冷凍管于放入和取出液氮桶時(shí)，均應(yīng)立刻將冷凍管再一次扭緊。

5.冷凍管應(yīng)如何解凍？

將冷凍管由液氮桶中取出解凍時(shí)，必須注意安全，可佩戴防護(hù)眼鏡和手套預(yù)防冷凍管的爆裂。取出冷凍管后，須立即放入 37 ℃ 水浴環(huán)境中快速解凍，輕搖冷凍管使其在 1 分鐘內(nèi)全部融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對(duì)細(xì)胞造成損害。并注意水面不可超過(guò)冷凍管蓋沿，否則易發(fā)生污染情形。

6.細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時(shí)，是否應(yīng)馬上去除 DMSO？

現(xiàn)在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室會(huì)在解凍細(xì)胞后加培養(yǎng)液將DMSO除去，但也有研究者認(rèn)為除少數(shù)特別注明對(duì) DMSO 敏感的細(xì)胞外，絕大部分細(xì)胞株（包括懸浮性細(xì)胞），在解凍之后，可直接放入含有 10~15 ml 新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)角瓶中，待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除 DMSO 即可，如此可避免大部分解凍后細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)或貼附的問(wèn)題。

細(xì)胞培養(yǎng)用液

7.如何正確選擇培養(yǎng)基種類(lèi)？

引用幾款比較經(jīng)典的培養(yǎng)基舉例：

8.如何選用特殊細(xì)胞系培養(yǎng)基？

培養(yǎng)某一類(lèi)型細(xì)胞沒(méi)有固定的培養(yǎng)條件。在 MEM 中培養(yǎng)的細(xì)胞，很可能在 DMEM 或 M199 中同樣很容易生長(zhǎng)。總之，MEM 做粘附細(xì)胞培養(yǎng)，RPMI-1640 做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)是一個(gè)好的開(kāi)始。

9.什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅？

酚紅在培養(yǎng)基中被用來(lái)作為 PH 值的指示劑：中性時(shí)為紅色，酸性時(shí)為黃色，堿性時(shí)為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類(lèi)激素的作用（特別是雌激素）。為避免固醇類(lèi)反應(yīng)，培養(yǎng)細(xì)胞，尤其是哺乳類(lèi)細(xì)胞時(shí)，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測(cè)，一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測(cè)時(shí)，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。

10.細(xì)胞培養(yǎng)基的配制和儲(chǔ)存應(yīng)該注意什么？

細(xì)胞培養(yǎng)基配好后，要先抽取少許放入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)放置24~48h，已檢測(cè)培養(yǎng)液是否有污染，然后方可用于實(shí)驗(yàn)。配置培養(yǎng)基所需的血清要合格并且保持穩(wěn)定。一個(gè)批號(hào)試用效果良好后，就可一次購(gòu)入較多同一批號(hào)的血清，這樣實(shí)驗(yàn)條件穩(wěn)定，配液時(shí)調(diào)整pH值較容易。每次配液量以使用兩周左右的量為宜，一次配液不要太多，一是短期內(nèi)用不完造成營(yíng)養(yǎng)成分損失需要補(bǔ)充，二是量大易造成污染。

11.為何培養(yǎng)基保存于 4 ℃ 冰箱中，顏色會(huì)偏紫色？

培養(yǎng)基保存于 4 ℃ 冰箱中，培養(yǎng)基內(nèi)的 CO2 會(huì)逐漸溢出，造成培養(yǎng)基越來(lái)越偏堿性，而培養(yǎng)基中的酸堿指示劑 （通常為 phenol red） 的顏色也會(huì)隨堿性增加而更偏紫色。培養(yǎng)基偏堿的結(jié)果， 將造成細(xì)胞生長(zhǎng)停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時(shí)，可以通入無(wú)菌過(guò)濾 CO2，以調(diào)整 pH 值。

12.什么情況下用到無(wú)血清培養(yǎng)基？

對(duì)于應(yīng)用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行分離制備細(xì)胞生長(zhǎng)因子、單克隆抗體等應(yīng)該選擇無(wú)血清培養(yǎng)基。

13.如何選擇正確的血清種類(lèi)？

14.可否使用與原先培養(yǎng)條件不同的血清種類(lèi)？

不能。血清是細(xì)胞培養(yǎng)上一個(gè)極為重要的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，所以血清的種類(lèi)和品質(zhì)對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生極大的影響。來(lái)自不同物種的血清，在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯(cuò)誤常會(huì)造成細(xì)胞無(wú)法存活。

15.血清滅活是否必須？

一般情況下不建議。熱滅活是以 56℃，30 分鐘來(lái)處理已解凍的血清，因?yàn)榇思訜岵襟E，可以使補(bǔ)體去活化，而補(bǔ)體所參與的反應(yīng)有：溶細(xì)胞活性，平滑肌的收縮，肥大細(xì)胞和血小板組胺的釋放，增強(qiáng)吞噬作用，淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的趨化和激活。

實(shí)驗(yàn)顯示，經(jīng)過(guò)正確處理的熱滅活血清，對(duì)大多數(shù)的細(xì)胞而言是不需要的。經(jīng)此處理過(guò)的血清對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)只有微小的促進(jìn)，或*沒(méi)有任何作用，甚至通常因?yàn)楦邷靥幚碛绊懥搜宓馁|(zhì)量，而造成細(xì)胞生長(zhǎng)速率的降低。而經(jīng)過(guò)熱處理的血清，沉淀物的形成會(huì)顯著的增多， 這些沉淀物在倒立顯微鏡下觀察，像是 "小黑點(diǎn)"，常常會(huì)讓研究者 誤以為是血清遭受污染，而把血清放在 37C 環(huán)境中，又會(huì)使此沉淀 物更增多，使研究者誤認(rèn)為是微生物的分裂擴(kuò)增。因此除了做免疫學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)和培養(yǎng)一些特定細(xì)胞，如平滑肌細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞等，不需要做熱滅活處理。

16.培養(yǎng)基中是否添加抗生素？

除特殊篩選系統(tǒng)中外，一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下，培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素。

17.何時(shí)更換培養(yǎng)基？

視細(xì)胞生長(zhǎng)密度而定，或遵照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上的更換時(shí)間，按時(shí)更換培養(yǎng)基即可。

細(xì)胞傳代

18.細(xì)胞傳代的方法都有哪些？

根據(jù)不同的細(xì)胞采取不同的方法。貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞用消化法傳代；部分貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞用直接吹打即可傳代；懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞可以采用直接吹打或離心分離后傳代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打。

19.原代培養(yǎng)的傳代應(yīng)注意的問(wèn)題？

細(xì)胞沒(méi)有生長(zhǎng)到足以覆蓋瓶底壁的大部分表面以前，不要急于傳代；原代培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞多為混雜生長(zhǎng)，不同的細(xì)胞有不同的消化時(shí)間，因此要根據(jù)需要注意觀察及時(shí)處理，并根據(jù)不同細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶的耐受時(shí)間而分離和純化所需要的細(xì)胞；

吹打細(xì)胞時(shí)動(dòng)作要輕巧盡可能減少對(duì)細(xì)胞的損傷；傳代時(shí)細(xì)胞接種數(shù)量要多一些，使細(xì)胞能盡快適應(yīng)新環(huán)境而利于細(xì)胞生存和增值；隨消化分離而脫落的組織塊也可一并傳入新的培養(yǎng)瓶。

20.使用胰蛋白酶時(shí)加入EDTA的目的？應(yīng)如何處理？

EDTA作用較胰蛋白酶緩和，主要作用在于能從組織生存環(huán)境中吸取Ca2+、Mg2+，這些離子是維持組織完整的重要因素。但EDTA單獨(dú)使用不能使細(xì)胞*分散，因而常與胰蛋白酶按不同比例混合使用，效果較好。常用比例為1：1或者2份EDTA：1份胰蛋白酶。EDTA的工作液濃度為0.02%，用不含Ca2+、Mg2+的BSS配置。如果使用EDTA，在終止消化前，需用緩沖液將消化液清除后才能加培養(yǎng)液。第一次開(kāi)瓶后應(yīng)立即少量分裝于無(wú)菌試管中，保存于 –20 ℃，避免反復(fù)冷凍解凍造成胰蛋白酶的活性降低，并可減少污染的機(jī)會(huì)。

21.欲將一般動(dòng)物細(xì)胞離心下來(lái)，其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速？

欲回收動(dòng)物細(xì)胞，其離心速率一般為800~1000 rpm，5~10 分鐘，過(guò)高的轉(zhuǎn)速，將造成細(xì)胞死亡。

22.細(xì)胞的接種密度為何？

依照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上的接種密度或稀釋分盤(pán)的比例接種即可。細(xì)胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)的重要原因之一。

23.細(xì)胞交叉污染的可能原因？

多種細(xì)胞系進(jìn)行維持傳代操作時(shí)，各細(xì)胞系所需的器材和溶液沒(méi)有嚴(yán)格分開(kāi)，往往會(huì)使一種細(xì)胞被另一種細(xì)胞污染。